Senin, 15 September 2014

Makalah Kultur Jaringan

Makalah Bioteknologi

KULTUR JARINGAN TUMBUHAN

Logo Unimed-FMIPA.gif

Disusun Oleh :

Devi Fitrianingsih
Fretty Juniarti
Nira Wati
Siti Hardiyanti
Yuli Hardiyanti

Biologi Nondik A 2012

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Negeri Medan
2014
KATA PENGANTAR

Puji Syukur kami ucapkan kepada Allah SWT yang telah memberikan kami nikmat Iman, kesehatan, serta keselamatan sehingga kami dapat menyelesaikan tugas makalah dari mata kuliah Bioteknologi yang berjudul “Kultur Jaringan Tumbuhan”.
            Makalah ini berisi 3 bab yakni bab 1 berupa pendahuluan yang merupakan uraian gambaran umum dari kultur jaringan. Bab 2 berupa pembahasan dari kultur jaringan berupa sejarah kultur jaringan, pengertian kultur jaringan, media serta alat yang digunakan dalam kultur jaringan dan aplikasi kultur jaringan tumbuhan. Dan bab 3 berupa kesimpulan yang berupa ringkasan dari pembahasan.
            Harapan kami semoga makalah ini membantu menambah pengetahuan dan pengalaman bagi para pembaca, sehingga saya dapat memperbaiki bentuk maupun isi makalah ini sehingga kedepannya dapat lebih baik. saya menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu kritik dan saran dari semua pihak yang bersifat membangun selalu diharapkan demi kesempurnaan makalah ini.
Akhir kata, kami sampaikan terima kasih kepada semua pihak yang telah berperan serta dalam penyusunan 



Medan, 13 Maret 2014


       Penulis





DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR                                                                                     ii
DAFTAR ISI                                                                                                     iii
BAB I  PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang                                                                                        1
1.2 Rumusan Masalah                                                                                   1
1.3 Tujuan                                                                                                     2
BAB II PEMBAHASAN
2.1 Sejarah Kultur Jaringan Tumbuhan                                                         3
2.2 Pengertian Kultur Jaringan Tumbuhan                                                    3
2.2.1 Konsep Skoog dan Miller                                                                5
2.3 Landasan Kultur Jaringan Tumbuhan                                                     6
2.4 Tujuan Kultur Jaringan Tumbuhan                                                          6
2.5 Jenis Kultur Jaringan Tumbuhan                                                             10
2.6 Media Kultur Jaringan Tumbuhan                                                          16
2.7 Metode Kutur Jaringan Tumbuhan                                                         19
2.8 Hormon Kultur Jaringan Tumbuhan                                                       22
2.9 Kelebihan dan Kekurangan Kultur Jaringan Tumbuhan                         31
2.10 Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan                                             32
2.11 Aklimatisasi Tanaman Hasil Kultur In Vitro                                         38
2.12 K ultur Jaringan Tanaman Manggis                                                      39
BAB III PENUTUP
3.1 Kesimpulan                                                                                             47
DAFTAR PUSTAKA                                                                                      49





BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
            Perkembangan bioteknologi salah satunya adalah kultur jaringan, yang hingga sekarang berkembang begitu cepat dan signifikan. Apa dasar utama yang menjadikan kultur jaringan berkembang dengan cepat? Salah satunya  adalah teknik pemakaian kultur jaringan yang dengan hanya menggunakan bagian sel tumbuhan, maka akan didapatkan tanaman yang sempurna yang dapat melakukan reproduksi. Jadi sebenarnya apa yang dimaksud dengan kultur jaringan? Kultur Jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tumbuhan seperti protoplasma sel, jaringan atau organ yang serba steril, ditumbuhkan pada media buatan yang steril dalam botol kultur yang steril dan dalam kondisi yang aseptic, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap. Beberapa teknik dalam kultur jaringan menuntut syarat-syarat tertentu yang harus dipenuhi dalam pelaksanaanya, dan syarat pokok kultur jaringan adalah laboratorium dengan segala fasilitasnya berupa alat-alat kerja, sarana pendukung terciptanya kondisi aseptic terkendali dan fasilitas dasar seperti air, listrik maupun bahan bakar.

1.2 Rumusan Masalah
1.      Bagaimana pengertian kultur jaringan secara umum?
2.      Bagaimana sejarah singkat dari kultur jaringan tumbuhan?
3.      Bagaimana teknik dan media sert alat yang digunakan dalam kultur jaringan tumbuhan?
4.      Bagaimana implementasi kultur jaringan pada beberapa species tumbuhan?
5.      Bagaimana keuntungan dan kerugian dari kultur jaringan tumbuhan?





1.3 Tujuan
1.      Mengetahui pengertian kultur jaringan secara umum.
2.      Mengetahui sejarah singkat dari kultur jaringan tumbuhan.
3.      Mengetahui teknik dan media sert alat yang digunakan dalam kultur jaringan tumbuhan.
4.      Mengetahui implementasi kultur jaringan pada beberapa species tumbuhan.
5.      Mengetahui keuntungan dan kerugian dari kultur jaringan tumbuhan.




















BAB II
PEMBAHASAN
2.1 Sejarah Kultur Jaringan
Orang yang melakukan kultur jaringana tumbuhan adalah :
o   Tahun 1904 Hannig melakukan kultur embrio pada tanaman cruciferae.
o   Tahun 1922 Knudson berhasil mengecambahkan anggrek secara in vitro.
o   Tahun 1922 Robbins mengkulturkan ujung akar secara in vitro.
o   Tahun 1939 Skoog dkk telah menemukan sitokinin dan orang pertama yang sukses dalam melakukan kultur jaringan.
o   Tahun 1940 Gautheret melakukan ku.ltur jaringan kambim secara in vitro pada tanaman Ulmus untuk study pembentukan tunas adventif.
o   Tahun 1941 Van Overbeek menggunakan air kelapa untuk campuran media dalam kultur Datura.
o   Tahun 1944 Skoog membentuk tunas adventif pertama pada kultur tembakau secara in vitro.
o   Tahun 1946 Ball melakukan proses penanaman lengkap pertama dapat dihasilkan dari eksplan kultur tunas ujung pada Lupinus dan Tropaeolum.
o   Tahun 1954 Muir berhasil menumbuhkan tanaman lengkap dari kultur sel tunggal.
o   Tahun 1955 Miller dkk  menemukan kinetin yang dapat memacu pembelahan sel.
o   Tahun 1964 Guha dapat memproduksi tanaman haploid pertama.
o   Tahun 1971 Takebe melakukan penanaman lengkap dihasilkan dari eksplan protoplas.

2.2 Pengertian Kultur Jaringan
Kultur jaringan atau budidaya in vitro adalah suatu  metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, jaringan atau organ yang serba steril, ditumbuhkan pada media buatan yang steril, dalam botol kultur yang steril dan dalam kondisi yang aseptik, sehingga bagianbagian tersebut dapat memperbayak diri dan beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap.
Kultur jaringan tanaman bermula dari pembuktian teori totipotensi sel yang dikemukakan oleh Schwann dan Schleiden (1838). Menurut teori ini, setiap sel tanaman hidup mempunyai informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman utuh, jika kondisinya sesuai.
Kultur jaringan adalah serangkaian kegiatan yang dilakukan untuk membuat bagian tanaman (akar, tunas, jaringan tumbuh tanaman) tumbuh menjadi tanaman utuh (sempurna) dikondisi invitro (didalam gelas). Jadi Kultur in vitro dapat diartikan sebagai bagian jaringan yang dibiakkan di dalam tabung inkubasi atau cawan petri dari kaca atau material tembus pandang lainnya. Secara teoritis teknik kultur jaringan dapat dilakukan untuk semua jaringan, baik dari tumbuhan, hewan, bahkan juga manusia, karena berdasarkan teori Totipotensi Sel (Total Genetic Potential), bahwa setiap sel memiliki potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi tanaman lengkap. Sel dari suatu organisme multiseluler di mana pun letaknya, sebenarnya sama dengan sel zigot karena berasal dari satu sel tersebut, setiap sel berasal dari satu sel.
Menurut Suryowinoto (1991), kultur jaringan dalam bahasa asing disebut sebagai tissue cultureKultur adalah budidaya dan jaringan adalah sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. jadi, kultur jaringan berarti membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat seperti induknya.
Kultur jaringan (Tissue Culture) merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril.
Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril. 

2.2.1 Konsep Skoog dan Miller
Skoog dan Miller mengemukakan bahwa regenerasi tunas dan akar in vitro dikontrol secara hormonal oleh ZPT sitokinin dan auksin. Organogenesis adalah proses terbentuknya organ seperti tunas atau akar, baik secara langsung dari permukaan eksplan atau secara tidak langsung melalui pembentukann kalus terlebih dahulu.
Dengan menggunakan eksplan empulur tembakau Skoog dan Miller mendemonstrasikan bahwa nisbah sitokinin dan auksin yang tinggi mendorong pembentukann tunas, sedangkan nisbah sitokinin dan auksin yang rendah mendorong pembentukann akar. Jika diberikan dalam jumlah yang seimbang sitokinin dan auksin akan mendorong pembentukann kalus.
Disamping merangsang pembentukann tunas adventif, sitokinin juga merangsang multiplikasi tunas aksilar dan melawan dominasi apikal. Sedangkan auksin merangsang pembentukann akar adventif. Semua perbanyakan tunas tersebut dirangsang oleh sitokinin benziladenin (BA) dalam media kultur (1957).



2.3 Landasan Kultur Jaringan
            Landasan kultur jaringan didasarkan atas tiga kemampuan dasar dari tanaman, yaitu:
1. Totipotensi adalah potensi atau kemampuan dari sebuah sel untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman secara utuh jika distimulasi dengar benar dan sesuai. Implikasi dari totipotensi adalah bahwa semua informasi tentang pertumbuhan dan perkembangan suatu organisme terdapat di dalam sel. Walaupun secara teoritis seluruh sel bersifat totipotensi, tetapi yang mengekspresikan keberhasilan terbaik adalah sel yang meristematik.
2. Rediferensiasi adalah kemampuan sel-sel masak (mature) kembali menjadi ke kondisi meristematik dan dan berkembang dari satu titik pertumbuhan baru yang diikuti oleh rediferensiasi yang mampu melakukan reorganisasi manjadi organ baru.
3. Kompetensi menggambarkan potensi endogen dari sel atau jaringan untuk tumbuh dan berkembang dalam satu jalur tertentu. Contohnya embrioagenikali kompeten sel adalah kemampuan untuk berkembang menjadi embrio funsional penuh. Sebaliknya adalah non-kompeten atau morfogenetikali tidak mempunyai kemampuan.

2.4 Tujuan Kultur Jaringan
            Saat ini teknik kultur jaringan tumbuhan bukan hanya sebagai sarana untuk mempelajari aspek-aspek fisiologi dan biokimia tanaman saja, tetapi sudah berkembang menjadi metode untuk berbagai tujuan yakni :
a. Mikropropagasi (perbanyakan tanaman secara mikro)
Teknik kultur jaringan telah digunakan dalam membantu produksi tanaman dalam skala besar melalui mikropropagasi atau  perbanyakan klonal dari berbagai jenis tanaman. Jaringan tanaman dalam jumlah yang sedikit dapat menghasilkan ratusan atau ribuan tanaman secara terus menerus. Teknik ini telah digunakan dalam skala industri di berbagai negara untuk memproduksi secara komersial berbagai jenis tanaman seperti tanaman hias (anggrek, bunga potong, dll.), tanaman buah-buahan (seperti pisang), tanaman industri dan kehutanan (kopi, jati, dll). Dengan menggunakan metoda kultur jaringan, jutaan tanaman dengan sifat genetis yang sama dapat diperoleh hanya dengan berasal dari satu mata tunas. Oleh karena itu metoda ini menjadi salah satu alternatif dalam perbanyakan tanaman secara vegetatif.
b. Pebaikan Tanaman
            Dalam usaha perbaikan tanaman melalui metoda pemuliaan secara konvensional, untuk mendapatkan galur murni diperlukan waktu enam sampai tujuh generasi hasil penyerbukan sendiri maupun persilangan. Melalui teknik kultur jaringan, dapat diperoleh tanaman homosigot dalam waktu singkat dengan cara memproduksi tanaman haploid melalui kultur polen, antera atau ovari yang diikuti dengan penggandaan kromosom. Tanaman homosigot ini dapat digunakan sebagai bahan pemuliaan tanaman dalam rangka perbaikan sifat tanaman.
c. Produksi Tanaman yang Bebas Penyakit
            Teknologi kultur jaringan telah memberikan kontribusinya dalam mendapatkan tanaman yang bebas dari virus. Pada tanaman yang telah terinfeksi virus, sel-sel pada tunas ujung (meristem) merupakan daerah yang tidak terinfeksi virus. Dengan cara mengkulturkan bagian meristem akan diperoleh tanaman yang bebas virus.
d. Transformasi Genetik
            Teknik kultur jaringan telah menjadi bagian penting dalam membantu keberhasilan rekayasa genetika tanaman (transfer gen). Sebagai contoh transfer gen bakteri (seperti gen cry dari Bacillus thuringiensis) ke dalam sel tanaman akan terekspresi setelah regenerasi tanaman transgeniknya tercapai.
e. Produksi Senyawa Metabolit Sekunder 
Jadi, Kultur jaringan tumbuhan juga dapat digunakan untuk memproduksi senyawa biokimia (metabolit sekunder) seperti alkaloid, terpenoid, phenyl propanoid dll. Teknologi ini sekarang sudah tersedia dalam skala industri. Sebagai contoh produksi secara komersial senyawa “shikonin” dari kultur sel Lithospermum erythrorhizon.
Kegunaan utama dari kultur jaringan adalah untuk mendapatkan tanaman baru dalam jumlah banyak dalam waktu yang relatif singkat, yang mempunyai sifat fisiologi dan morfologi sama persis dengan induknya. Dari teknik kultur jaringan tanaman ini diharapkan juga memperoleh tanaman baru yang bersifat unggul.  
Secara lebih rinci dan jelas berikut ini akan dibahas secara khusus manfaat dari kultur jaringan  antara lain:
v  Mendapatkan tanaman baru dalam jumlah banyak dalam waktu yang relatif singkat, yang mempunyai sifat fisiologi dan morfologi sama persis dengan induknya. Dari teknik kultur jaringan tanaman ini diharapkan juga memperoleh tanaman baru yang bersifat unggul.
v  Dapat diperoleh sifat-sifat tanaman yang dikehendaki
v  Metabolit sekunder tanaman segera didapat tanpa perlu menunggu tanaman  dewasa
v  Produksi tanaman bebas virus dengan teknik kultur meristem.
v  Pelestarian plasma nutfah tanaman juga dapat dilakukan dengan teknik kultur jaringan dengan penyimpanan untuk jangka panjang dengan penggunaan nitrogen cair pada temperatur –196oC. Ada juga penyimpanan sementara, yaitu pada temperatur antara 0oC sampai –9oC.
v  Untuk dapat menghasilkan tanaman dengan jumlah banyak dan beragam.
v  Perbanyakan tanaman secara besar-besaran telah dibuktikan keberhasilannya pada perkebunan kelapa sawit dan tebu. Dengan cara kultur jaringan dapat klon suatu komoditas tanaman dalam relatif cepat. Manfaat yang dapat diperoleh cukup banyak, misalnya: di luar pulau Jawa akan didirikan suatu perkebunan yang membutuhkan bibit tanaman dalam jumlah ribuan, maka sudah dapat dibayangkan betapa mahalnya biayanya hanya untuk trasnportasi saja. Hal ini dapat diatasi denga usaha kultur jaringan, karena hanya perlu membawa beberapa puluh botol planlet yang berisi ribuan bibit. Dengan cara ini dapat menghemat waktu dan biaya yang cukup banyak dalam persiapan pemberangkatan ataupun transportasinya. Pada ekspor anggrek, misalnya, orang luar negeri menghendaki bunga anggrek yang seragam baik bentuk maupun warnanya. Dalam hal ini dapat dipenuhi juga dengan usaha kultur jaringan. Bibit-bibit tanaman dari usaha mericlono (tanaman hasil budidaya meristem) akan berharga lebih mahal, karena induknya dipilih dari tanaman yang mempunyai sifat paling bagus (unggul).
v  Usaha yang paling tepat untuk melestarikan tanaman yang terancam punah. Dengan usaha kultur jaringan ini, populasi dari tanaman tersebut akan terselamatkan, bahkan dapat bertambah, sekaligus sifat-sifat yang dimiliki oleh tanaman tersebut tetap terjamin.
v  Kultur jaringan juga mempunyai manfaat yang besar dibidang farmasi, karena dari usaha ini dapat dihasilkan metabolit skunder upaya untuk pembuatan obat-obatan, yaitu dengan memisahkan unsur-unsur yang terdapat di dalam kalus ataupun protokormus, misalnya alkoloid, steroid, dan terponoid. Dengan ditemukannya cara mendapatkan metabolit skunderdari kalus suatu eksplan yang di tumbuhkan dalam medium kultur jaringan, maka berarti dapat menghemat waktu dan tenaga. Persenyawaan yang bermanfaat yang diambil dari kalus dapat ditingkatkan kadarnya dengan cara memanipulasinya.
v  Kultur jaringan juga sangat bermanfaat dibidang fisiologi tanaman. Pada tanaman anggrek misalnya, telah berhasil diketahui bahwa jika ujung akarnya diiris melintang akan memperlihatkan warna tertentu. Warna tersebut nantinya akan sama dengan warna bunganya. Hal ini sangat berguna dalam bidang perdangan bunga hias, sebab walaupun tanamannya belum berbunga orang sudah dapat mengetahui warna bunga yang akan muncul.
v  Melalui perbanyakan vegetatif dengan kultur jaringan ternyata juga berpengaruh terhadap devisa negara. Misalnya, dengan terlaksananya ekspor tanaman anggrek ke negara lain, maka akan menaikkan devisan negara dibidang pertanian.
v    Pelaksanaannya tidak tergantung pada musim

2.5 Jenis Kultur Jaringan Tumbuhan
1.      Kultur meristem
Kultur meristem adalah kultur yang menggunakan eksplan yang berasal dari jaringan meristem, biasanya di peroleh dari meristem apikalnatau meristem tunas aksilar. Pada ujung pucuk, jaringan ini berada dibagian dalam, oleh karena itu, untuk mengambil jaringan ini agar dapat digunakan sebagai eksplan, kita membutuhkan mikroskop.
Jadi pada setiap pengambilan sampel, terlebih dahulu dilakukan pengirisan bagian pucuk secara transversal, lalu jaringan meristem yang tertutupi oleh primordia daun akan dapat diambil, semua kegiatan ini dilakukan dibawah mikroskop. Apabila kultur meristem ini adalah untuk mengeliminir penyakit, terutama virus, karena jaringannya jauh berada dibagian dalam, sehingga penetrasi penyakit diharapkan belum menjauhkan jaringan ini, penyimpanan plasma nutfah bebas virus.
Kultur meristem telah banyak diterapkan pada berbagai tanaman. Pada anggrek cymbidium, ternyata dengan teknik ini dapat dihasilkan kelipatan jumlah planlet dibanding kultur lainnya. Tanaman yang dihasilkan dari kultur meristem ini berasal dari jaringan vegetatif, sehingga planlet yang dihasilkan berupa klon ( seragam ).
Untuk pelaksanaan perbanyakan mikro dengan teknik kultur jaringan ini, apabila kita mengguanakan eksplannya adalah daerah meristem pucuk (yaitu bagian ujung dari pucuk, dimana jaringannya terdapat dibagian dalam dan banyak dilapisi oleh jaringan – jaringan primordial yang nantinya akan membentuk tunas dan daun ) yang berukuran sangat kecil ( 0,2 mm ), dan dalam pelaksanaanya digunakan perlakuan pemberian zat kimia untuk membunuh penyakit, maka hasi yang diperoleh kemungkinan besar adalah bebas patogen.
Tanaman yang dihasilkan dari kultur meristem disebut meriklon ( mericlone ). Saat ini sudah banyak beredar anggrek meriklon terutama, vanda dan cymbidium, karena harganya yang cukup mahal. Namun sayangnya anggrek – anggrek tersebut adalah hasil import dari negara Taiwan. Tanaman meriklon lainnya adalah kedelai, kentang, anyelir, capsella.
Melalui kultur m eristem, jaringan meristem sebagai sumber eksplan dapat langsung diregenerasikan untuk membentuk tunas dengan subkultur berulang dan menggunakan variasi ZPT, atau melalui fase kalus terlebih dahulu, seperti yang telah dilakukan ahli kultur jaringan morel, yang memperoleh meristem poucuk anggrek yang bebas virus, kemudian dikulturkan membentuk kalus, kemudian dikulturkan untuk membentuk protocorm dan akhirnya dikulturkan untuk berdiferensiasi lebih lanjut guna membentuk tunas dan akar.
2. Kultur protoplasma
Protoplas adalah sel dalam keadaan telanjang. Fusi protoplas (yang terjadi didalam sel tanpa campur tangan manusia) adalah proses alamiah yang terjadi pada tumbuhan rendah sampai tingkat tinngi. Pada proses pembuahan terjadi penyatuan gamet jantan (sub protoplas) dengan gamet betina (protoplas) menjadi zigot (hibrida seksual). Sel-sel tanaman tingkat tinggi berhubungan satu dengan lainnya melalui plasmodesmata, hubungan sel melalui plasmodesmata ini merupakan fusi protoplas dengan protoplas terapi terjadi secara alamiah.
            Modifikasi genetik dengan fusi protoplas bertujuan untuk :
v  Mengatasi masalah ilompatibilitas
v  Mengatasi masalah sterilitas
v  Mendapatkan sifat yang diinginkan
v  Melalui fusi sel guna menghasilkan hibrida somatik
v  Mendapatkan tanaman bebas virus, penyakit
v  Mendapatkan tanaman dengan variasi somaklonal yang baik
Protoplas dapat diisolasi secara mekanik dengan menggunakan prinsip proses  plasmolisis sel, juga dapat diisolasi secara enzimatis. Umummnya saat ini digunakan cara terakhir ini. Enzim-enzim digunakan untuk mengisolasi protoplas antara lain : sellulase, driselase. Zymolase, pectiolyase, pectinase, hemisellulase, maserase.
Sumber protoplas yang umum untuk diisolasi adalah : daun (paling sering digunakan), pucuk, buah, akar, nodul akar. Jaringan mesofil daun (diutamakan berasal dari in-vitro) yang paling mudah diisolasi karena susunannya yang jarang sehingga penetresi enzim lebih cepat.
Seluruh rangkaian isolasi protoplas, menurut sterilitas lebih tinggi dibanding dengan kultur in vintro biasa. Hal ini di karenakan kita bekerja dengan sel telanjang. Media untuk mengkulturkan protoplas maupun hasil fusi hasil protoplas umumnya adalah media Ms atau Bs dengan berbagai modifikasi garam mineral ZPT.
Osmotikum sangat dibutuhkan mulai dari prosesi isolasi mengkulturkan hasil fusi protoplas, hingga terbentuk dinding sel. Larutan osmotikum biasanya digunakan mannitol dan sorbitol. Setelah dinding sel terbentuk maka harus diteteskan media tanpa manitol atau sorbitol, untuk menurunkan tekanan osmotik. Jika tekanan osmotik tetap tinggi dan regenerasi sel menjadi terhambat.
Fusi sel (protoplas) tanaman dilakukan dengan cara memfusikan dua macam protoplas yang sama atau berbeda. Teknik fusi protoplas yang dikembangkan saat ini:
v   Fusi antara protoplas dengan protoplas
v   Fusi antara sub prtoplas dengan protoplas
v   Fusi antara sub protoplas dengan sub protoplas sub protoplas terdiri dari sitoplasma ( protoplas tanpa inti ), inti (karyoplas, protoplas mini), kloroplas mitokondria.
3. Kultur Kalus
Pada awal kultur kalus bertujuan untuk mempelajari proses dediferensiasi dan diferensiasi sel dan jaringan pada kultur in vitro dan memperoleh kalus dari eksplan yang dikulturkan. Saat ini kultur kalus dan suspensi sel banyak dilakukan dalam penelitian untuk menghasilkan metabolit sekunder.
Kalus adalah kumpulan masa sel yang amorphus yang terdiri dari sel-sel atau jaringan-jaringan yang membelah diri terus menerus. Kalus tersusun oleh sel-sel parenkim yang mana ikatannya dengan sel lainnya sangat rengggang. Jaringan ini belum mengalami deferensiasi lanjut. Untuk menginduksi terbentuknya tunas diperlukan media regenerasi dengan modifikasi  ZPT.
Kemampuan jaringan dalam menbentuk kalus sangat terkait dengan:
v  Umur fisiologi jaringan waktu isolasi dilakukan. Jaringan yang masih meristematis lebih mudah penanganannya dibanding jaringan yang sudah berdeferensiasi
v  Musim pada saat tanaman diisolasi
v  Jenis tanaman-tanaman berkayu seperti manggis sangat sulit untuk mendapatkan kalus yang variable.
v  Bagian tanaman yang diisolasi, bagian yang sudah tua akan memerlukan modifikaasi dengan merejuvenilisasikan sel nya kembali.
Medium yang digunakan untuk kultur kalus adalah medium dasar dengan modifikasi ZPT. Umumnya digunakan auksin 2,4-0, kadang-kadang digunakan bahan organik kompleks seperti sari pisang, air kelapa.
Eksplan yang digunakan untuk menginduksi kalus adalah : batang, akar, daun, embrio, kotiledon dan lainnya. Eksplan awal ini kemudian ditempatkan pada media padat. Kalus yang tumbuh, harus disubkultur ke media baru dalam kurun waktu tertentu, agar keterwidiaan hara dan airnya tetap ada dan mencegah terhambatnya pertumbuhan kalus akibat keluarnya senyawa-senyawa hasil metabolisme kalus tersebut.
Subkultur dapat dilakukan ke media yang sama atau media regenerasi. Hal ini tergantung kepada tujuan subkultur tersebut. Untuk tujuan menghasilkan senyawa atau metabolit sekunder maka jangan menggunakan media regenerasi. Namun subkultur yang berulang-ulang dengan sumber eksplan yang terdiri dari sel-sel yang heterogen yang dapat menyebebkan perubahan berupa :
v  Aberasi kromosom, dapat terjadi pematahan kromosom, mengakibatkan terjadinya mutasi gen.
v  Poliploidi, yang disebabkan oleh pembelahan kromosom yang tidak diikuti dengan terbentuknya dinding sel anak, sehingga terjadi penggandaan jumlah kromosom.
v  Delesi, translokasi, substitusi
Untuk melakukan praktek kultur kalus, dari pengalaman penulis menunjukkan, penempatan pada daerah gelap tanpa sinar akan lebih memacu pembentukan kalus. Hal ini dapat kita pahami bersama karena untuk proses pembentukan kalus, zat pengatur tumbuh yang sangat berperan adalah auksin. Auksin akan sangat baik bekerja dengan kondisi gelap. Sementara dengan adanya cahaya maka kerja auksin akan terganggu, sehingga kalus yang dihasilkan juga tidak baik kualitasnya.
Perlakuan membungkus dengan kain hitam pada tanaman yang akan diinduksi kalusnya, pada tanaman krisan menunjukkan respon yang sangat baik, dengan memperlihatkan kumpulan kalus yang terbentuk lebih banyak dibanding botol yang tidak dibungkus kain hitam.
Kalus yang baik adalah kalus yang uriable dan mempunyai spot-spot hijau pada permukaan atasnya. Kalus yang padat akan sulit beregenerasi membentuk emrio somatik dan tunas.
4. Kultur Suspensi
Kultur suspensi sangat berguna dalam penelitian metabolit primer maupun sekunder, juga untuk regulasi nitrogen didalam organ dan asimilasi sulfur, metabolisme karbohidrat dan karbon fotosintetik. Namun kultur sel kulit dipakai untuk penelitian-penelitian path-way (biosintesis) senyawa tertentu.
Penelitian skoog dan miller (1957), mengenai keseimbangan hormon menjadi dasar penelitian selanjutnya, sampai pada penelitian mengenai transformasi dengan modifikasi menggunakan agrobacterium T-DNA.
Kultur sel dilakukan dengan menggunakan eksplan adalah kalus. Kalus dipindahkan ke media cair untuk menginduksi sel-sel independen atau inisiasi suspensi sel. Pada kutur sel ini juga harus dilakukan subkultur secara periodik, tergantung tujuannya yaitu ke media yang sama atau modifikasi untuk memperbanyak suspensi sel atau ke media regenerasi (media padat).  Untuk regenerasi harus didahulukan menginduksi munculnya tunas, setelah muncul tunas kemudian baru diinduksi pembentukan akar.
Umumnya kultur sel digunakan untuk :
v  Sumber protoplas 
v  Perlakuan dengan mutagen kimia, penyakit dan lain-lain.
v  Memproduksi metabolit sekunder
v  Untuk keperluan seleksi in vitro dalam pemuliaan tanaman
Kultur sel harus terus berkembang terutama untuk melihat hubungan tanaman dengan mikroba, tidak hanya dalam pembentukan tunas tetapi juga dalam proses biokimia dan perkembangan virus, phytotoksin, resistensi penyakit.
5. kultur anther/haploid
            Kultur anther (anther culture) sering juga disebut kultur haploid jika serbuk sari yang digunakan sebagai sumber eksplan maka disebut kultur serbuk sari (polen culture). Kultur serbuk sari ini lebih tepat disebut kultur haploid dibanding dengan kultur anther. Kultur haploid lain adalah kultur ovul, dimana sebagai sumber eksplannya adalaah ovul. Kultur haploid adalah kultur yang menghasilkan tanaman haploid. Tanaman haploid adalah tanaman yang memiliki jumlah kromosom yang sama dengan jumlah kromosom gamet (N).jadi tidak harus sama dengan kromosom dasar. Untuk tanaman diploid (2N), jumlah kromosom gamet (N) adalah sama dengan kromosom dasar, tetapi untuk tanaman tetraploid (4N) maka jumlah kromosom gamet adalah 2 kali kromosom dasar (N=2X). Dengan demikian istilah haploid pada tanaman tetraploid dibedakan atas dihaploid (N=2X) dan monohaploid (N=X)
            Keuntungan dari tanaman haploid adalah :
v  Semua sifat ditampilkan dalam kondisi monohaploid, baik sifat dominan ataupun resesif
v  Seleksi pada level haploid jauh lebih mudah dibanding level ploidi yang tinggi
v  Penggandaan kromosom tanaman haploid akan menghasilkan tanaman dihaploid yang homozigot, penggandaan kromosom berikutnya akan menghasilkan tanaman tetraploid homozigot
v  Hibridisasi seksual dengan tanaman diploid akan menghasilkan tanaman triploid

2.6 Media Kultur Jaringan Tumbuhan
            Media Kultur Jaringan merupakan faktor penentu dalam perbanyakan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media kultur yang baik seharusnya menyediakan  unsur hara baik makro maupun mikro, sumber vitamin dan asam amino. Sumber karbohidrat , zat pengatur tumbuh, senyawa organik sebagai tambahan seperti air kelapa, ekstrak buah, dll. Bahan pemadat berupa agar-agar dan gelrite dan juga menyediakan arang aktif untuk kasus  tertentu beberapa tanaman.
            Unsur hara makro dan mikro diberikan dalam bentuk garam-garam anorganik. Pada umumnya biasa diberikan dalam komposisi tertentu seperti media berupa MS, WPM, BS dll, tergantung dari jenis tanaman yang akan dikulturkan. Vitamin yang banyak digunakan adalah vitamin B12 (thiamin), nicotinic acid, vitamin B6, dan vitamin E atau C untuk antioksidan. Asam amino yang akan dipakai sebagai sumber N organik, yang biasa digunakan adalah glycine, asparagin, glutamine, alanin dan threonin.
            Media yang baik harus selalu berada pada PH yang optimal yaitu 5,5 – 5,8. Selain itu, harus dibuat dalam tempat steril, autoclave sering dipakai untuk sterilisasi dalam pembuatan media kultur jaringan.
Salah satu media kultur jaringan adalah :
A. GARAM-GARAM ANORGANIK
            Garam-garam mineral merupakan gabungan unsur-unsur esensial makro dan mikro. Konsentrasi optimum dari tiap-tiap komponen untuk mencapai kecepatan pertumbuhan yang maksimal untuk berbagai tanaman sangatlah bervariasi.

A.1 Unsur Makro
Merupakan unsur yang dibutuhkan dalam jumlah besar yang terdiri atas : C, H, O, N, S, P, K, Ca, dan Mg.
A.2 Unsur Mikro
Merupakan unsur yang dibutuhkan dalam jumlah sedikit yang terdiri atas : Cl, B, Mo, Mn, Cu, Fe, Zn, Co.
B. ZAT-ZAT ORGANIK
Zat-zat organik yang biasanya ditambahkan pada medium kultur jaringan adalah gula, myo-inosito, vitamin, asam-asam amino, dan zat pengatur tumbuh.
·         Gula
Gula diberikan pada medium kultur jarinagan berfungsi untuk sumber energy yang diperlukan untuk induksi dan pertumbuhan sel, kalus, tunas tanaman.
·         Myo-inositol
Myo-inositol ditambahkan pada medium untuk membantu differensiasi dan pertumbuhan jaringan. Myo-inositol merupakan perantara pada perubahan glukosa menjadi asam galakturonat, juga berperan sebagai precursor untuk pembentukan pektin dan penyusunan dinding sel.
·         Vitamin
Vitamin ditambahkan pada medium untuk mempercepat pertumbuhan dan differensiasi kalus, serta menurunkan stress tanaman/eksplan. George dan Sherringtone mengungkapkan beberapa macam vitamin yang umum digunakan pada berbagai macam medium dasar antara lain : Thiamin-HCl, Nicotinic, Acid, Pyridoxin HCl, Ca D-Pantotenate, Biotic, Folic, dan lain-lain.
·         Asam-asam Amino
Asam amino merupakan sumber N organik yang lebih cepat diambil daripada N anorganik didalam medium yang sama. Sumber N yang berbeda ini, akan memberikan pengaruh yang berbeda juga. Adapun asam-asam amino yang sering digunakan pada medium dasar, pada umumnya adalah : L-Argarin, L-Apartic acid, L-Cystein, L-Glutamate, L-Asparagin, L-Methionine, L-Tyrosine, Glycine.
·         Zat Pengatur Tumbuh
Merupakan komponen yang dibutuhkan untuk pembuatan media.
C. SUBSTANSI ORGANIK KOMPLEKS
            Banyak jenis subtansi organic kompleks yang telah dicobakan ke medium kultur jaringan antara lain yeast ekstraks, mal ekstraks, bermacam-macam bahan tanaman seperti air kelapa, endosperm jagung, orange juice, tomato juice, dll.
            Beberapa yang sudah digunakan adalah air kelapa, yang diindikasikan mengandung sitokinin endogen yang tinggi sehingga diharapkan dapat menginduksi tunas tanaman. Penelitian terakhir mendapatkan kandungan air kelapa yaitu asam amino, asam organic, asam nukleat, purin, gula, gula alcohol, vitamin, mineral, zat pengatur tumbuh.
            ZPT yang terdapa didalam air kelapa adalah :
1.      9-B-D ribofuranosyl zeatin
2.      Zeatin
3.      N-N-Diphenyl urea
4.      2(3-methyl but 2-eyl amino)-purin 6-one
Beberapa kelemahan subtansi organik kompleks ini (kecuali air kelapa) adalah tidak konsisten kadarnya dan tidak diketahui dengan pasti komposisinya.
Media kultur jaringan tumbuhan sangat ditentukan oleh :
PH Media
            PH tertentu dibutuhkan untuk pertumbuhan jaringan tanaman agar tidak mengganggu fungsi membrane sel dan PH sitoplasma. Jaringan yang ditumbuhkan pada medium kultur biasanya mempunyai PH berkisar antara 4,8-5,8. PH ini perlu dipertahankan selama medium kultur digunakan.
Bahan Pemadat
            Medium yang komposisinya sudah ditetapkan, diberi bahan pemadat. Bahan pemadat yang sering digunakan adalah agar-agar sejumlah 7-10 gr/l. Bahan pemadat lain yang jarang digunakan adalah gelrite, yakni bahan yang lebih bening dari pada agar-agar. Pemakaian gelrite juga lebih sedikit dibanding dengan agar-agar untuk mencapai kepadatan yang sama sekitar 2 gr/l.
            Penggunaan bahan pemadat baik gelrite maupun agar-agar memiliki banyak kelemahan yaitu :hanya sebagian eksplan yang kontak dengan medium terjadi gradient nutrisi yang tidak sama, mobilitas zat hara menjadi kurang baik dan terjadi akumulasi zat-zat toksik yang dikeluarkan oleh eksplan.
Arang Aktif
            Arang aktif merupakan arang yang dihasilkan dari proses pemanasan yang menggunakan uap atau udara yang panas. Bahan ini dapat mengabsorbsi berbagai bahan(zat). Banyak digunakan dalam medium inisiasi, regenasi, dan pengakaran tanaman kultur.
            Beberapa pengaruh zat arang aktif didalam kultur jaringan tumbuhan adalah :
ü  Mengabsorbsi senyawa toksik yang terdapat dalam media.
ü  Mengabsorbsi ZPT.
ü  Merangsang perakaran.
ü  Memacu pertumbuhan jumlah anakan.\

2.7 Metode Kultur Jaringan Tumbuhan
Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga  tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional.
Teknik kultur jaringan memanfaatkan prinsip perbanyakan tumbuhan secara vegetatif. Berbeda dari teknik perbanyakan tumbuhan secara konvensional, teknik kultur jaringan dilakukan dalam kondisi aseptik di dalam botol kultur dengan medium dan kondisi tertentu. Karena itu teknik ini sering kali disebut kultur in vitro. Dikatakan in vitro (bahasa Latin), berarti "di dalam kaca" karena jaringan tersebut dibiakkan di dalam botol kultur dengan medium dan kondisi tertentu. Teori dasar dari kultur in vitro ini adalah Totipotensi. Teori ini mempercayai bahwa setiap bagian tanaman dapat berkembang biak karena seluruh bagian tanaman terdiri atas jaringan-jaringan hidup. Oleh karena itu, semua organisme baru yang berhasil ditumbuhkan akan memiliki sifat yang sama persis dengan induknya.
Metode perbanyakan tanaman secara in vitro dapat dilakukan melalui tiga cara, yaitu melalui perbanyakan tunas dari mata tunas apikal, melalui pembentukan tunas adventif, dan embriogenesis somatik, baik secara langsung maupun melalui tahap pembentukan kalus. Ada beberapa tipe jaringan yang digunakan sebagai eksplan dalam pengerjaan kultur jaringan. Pertama adalah jaringan muda yang belum mengalami diferensiasi dan masih aktif membelah (meristematik) sehingga memiliki kemampuan regenerasi yang tinggi. Jaringan tipe pertama ini biasa ditemukan pada tunas apikal, tunas aksiler, bagian tepi daun, ujung akar, maupun kambium batang. Tipe jaringan yang kedua adalah jaringan parenkim, yaitu jaringan penyusun tanaman muda yang sudah mengalami diferensiasi dan menjalankan fungsinya. Contoh jaringan tersebut adalah jaringan daun yang sudah berfotosintesis dan jaringan batang atau akar yang berfungsi sebagai tempat cadangan makanan.
Tahapan Pelaksanaan Kultur Jaringan
Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah:
1)        Pembuatan media
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.  Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon.  Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain.  Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan.  Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca.  Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf.
2)    Inisiasi
Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas. 
3)
Sterilisasi
Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan.  Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril. 
4)    Multiplikasi
Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan.  Tabung reaksi yang telah ditanami ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar.
5)    Pengakaran
Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik.  Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri). 
6)    Aklimatisasi
Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif. 

2.8 Hormon Kultur Jaringan Tumbuhan
Istilah hormon mula-mula dipakai oleh ahli fisiologi hewan. Mereka maksudkan hormon adalah  senyawa-senyawa organik, efektif dalam konsentrasi rendah dibuat didalam sel pada bagian tertentu dari organisme dan diangkut  kebagian lain dari organisme tersebut dimana dihasilkan suatu perubahan fisiologi yang khusus. Oleh karena hewan mempunyai sistem sirkulasi yang lebih teratur, hormon-hormon itu dapat dikoleksi dalam jumlah yang banyak dan diidentifikasi. Para ahli juga dapat menelusuri tempat-tempat yang menjadi sasaran hormon tersebut.
Ahli-ahli fisiologi tumbuhan sangat dipengaruhi oleh konsep-konsep hormon hewan ini dan mereka mencari zat-zat yang serupa pada tumbuh-tumbuhan. Sifat beberapa zat pada tumbuh-tumbuhan. Sifat beberapa  zat pada tumbuh-tumbuhan dianggap menyerupai sifat-sifat hormon hewan sehingga  meyakinkan para ahli untuk memakai nama fithohormon atau hormon atau hormon tumbuhan. Penelitian akhir-akhir ini memungkinkan bahwa model hormon hewan tidak sesuai untuk model hormon tumbuhan.
Konsep hormon yang dikembangkan oleh para ahli fisiologi hewan bahwa hormon adalah bahan  bukan nutrisi yang aktif dalam konsentrasi rendah dapat termasuk baik senyawa-senyawa organik maupun ion-ion anorganik.
Kebanyakan ahli fisiologi tumbuhan menggunakan istilah Zat Pengatu Tumbuh tanaman (plant growth substance) daripada istilah hormon tanaman. Karena istilah tersebut dapat mencakup baik zat-zat endogen maupun zat eksogen (sintetic) ypertumbuhan tnaman. Zat pengatur tumbuh yang dapat mengubah pertumbuhan tanaman. Zat pengatur tanaman (ZPT) yang dihasilkan oleh tanaman disebut fitohormon, sedangkan yang sintetic disebut zat pengatur tumbuh tanaman sintetic.
Hormon tanaman harus memenuhi beberapa syarat berikut, yaitu :
1). Senyawa organik yang dihasilkan oleh tanaman sendiri
2) Harus dapat ditranslokasikan
3) Tempat sintesis dan kerja berbeda
4) Aktif dalam konsentrasi rendah.
Dikenal 5 golongan fitohormon yaitu: auksin, giberelin, sitokinin, asam absitat dan etilen. Fitohormon ini terdapat di dalam tanaman dalam berbagai bentuk, sehingga sulit untuk mengerti cara kerja fitohormon itu dengan cara baik. Selain itu tanaman juga mengandung senyawa-senyawa lain yang turut aktif dalam berbagai proses pertumbuhan dan perkembangan. Senyawa-senyawa itu, antara lain adalah asam polifenolik, vitamin, siklitol dan berbagai senyawa lain.
A. Auksin
1. Pengaruh Fisologis dari Auksin
IAA dan auksin lain berperan pada berbagai aspek pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Beberapa aspek diuraikan secara singkat sebagai berikut:
a.       Pembesaran Sel
Studi mengenai pertumbuhan koleoptil menunjukkan bahwa IAA dan auksin-auksin yang lain mendorong pembesaran sel tersebut. Perpanjangan koleoptil atau batang merupakan hasil dari pembesaran sel tersebut. Penyebaran yang tidak sama dari auksin ini menyebabkan pembesaran sel yang tidak merata dan terjadi pembengkokan dari koleoptil atau organ tanaman (geotropisma dan fototropisma.
b.      Penghambatan mata tunas samping
Pertumbuhan dari mata tunas samping dihambat oleh IAA yang diproduksi pada meristem apical yang diangkut secara basepetal. Konsentrasi auksin yang tinggi menghambat pertumbuhan mata tunas tersebut. Jika sumber auksin ini dihilangkan dengan jalan memotong meristem apical itu maka tunas samping ini akan tumbuh menjadi tunas.
c.       Absisi (pengguran daun)
Pengguran daun terjadi sebagai akibat dari proses absisi (proses-proses fisik dan biokimia) yang terjadi didaerah absisi. Daerah absisi adalah kumpulan sel yang terdapat pada pangkal tangkai daun. Proses absisi ada hubungannya dengan IAA pada sel-sel didaerah absisi.
d.      Aktivitas daripada kambium
Pertumbuhan sekunder termasuk pembelahan sel-sel di daerah kambium dan pembentukan jaringan xylem dan floem dipengaruhi oleh IAA. Pembelahan sel-sel di daerah kambium dirangsang oleh IAA.
e.       Pertumbuhan akar
Selang konsentrasi auksin untuk pembesaran sel-sel pada batang, menjadi penghambat pada pembesaran sel-sel akar. Selang konsentrasi yang mendorong pembesaran sel-sel pada akar adalah sangat rendah.
B. Giberelin
Zat pengatur tumbuh (ZPT) lain yang sering ditambahkan kedalam medium adalah giberelin, ZPT yang dalam bentuk larutan pada temperatur tinggi mudah kehilangan sifatnya sebagai ZPT. Giberelin dalam dosis tinggi menyebabkan gigantisme, sesuai dari penemuan awal yang menunjukkan bahwa ZPT ini berefek meningkatkan pertumbuhan sampai beberapa kali. Giberelin berpengaruh terhadap pembesaran dan pembelahan sel, pengaruh giberelin ini mirip dengan auksin yaitu antara lain pada pembentukan akar. Giberelin dapat menyebabkan terjadinya peningkatan jumlah auksin endogen.
1.      Giberelin pada Tumbuhan Berhijau Daun
Dengan dikembangkannya cara-cara analisis yang baru di dapat bahwa ekstrak dari kebanyakan tumbuhan mempunyai aktivitas GAL. Studi selanjutnya men unjukkan bahwa tumbuh-tumbuhan yang berhijau daun mengandung jenis-jenis GA yang serupa dengan GA yang disolasi dari Gibberella fujikuroi maupun bebrapa jenis GA yang baru.
GA yang paling umum adalah GA, GA3-8, dan GA17-20. Jadi GA hukan saja hasil metabolisme dari cendawan dengan pengaruh fisiologis yang menarik pada tumbuh-tumbuhan, tetapi juga merupakan zat pengatur tumbuh yang endogen. GA ini terdapat pada berbagai organ dan jaringan tumbuhan seperti akar, tunas, mata tunas, daun, bunga, bintil akar, buah dan jaringan kalus.
2.      Pengaruh Fisiologis dari Giberelin
Pengaruh GA terutama didalam perpanjangan ruas tanaman yang disebabkan oleh bertambah besar dan jumlah sel-sel pada ruas-ruas tersebut. Selain perpanjangan batang, giberelin juga memerperbesar luas daun dari berbagai jenis tanaman, jika disemprot GA. Demikian juga terhadap besar bunga dan buah. Besar bunga dari tanaman Camelia dan Gerannium akan bertambah besar jika diberi GA. Giberrelin juga mendorong pembentukan buah partenokapri (tanpa biji) pada buah anggur dan pada  buah-buahan lain.
Telah diselidiki juga bahwa proses dormansi dari beberapa biji dan mata tunas dapat dihilanhgkan dengan pemberian GA. Pada biji-biji tersebut perkecambahan dapat diawali dengan naiknya kadar GA endogen biji. Pada biji-biji tersebut dormansi disebabkan oleh rendahnya kadar GA endogen sehingga dormansi dapat diatasi dengan pemberian GA eksogen. Mekanisme yang serupa juga terdapat pada mata tunas tidur (dorman).
C. Sitokinin
Sitokinin berperan penting dalam pengaturan pembelahan sel dan morfogenesis. Sitokinin yang pertama kali ditemukan adalah kinetin. Kinetin bersama-sama dengan auksin memberikan pengaruh interaksi terhadap diferensiasi jaringan. Pada pemberian auksin dengan konsentrai relatif tinggi, diferensiasi kalus cenderung kearah pembentukan primordia akar, sedangkan pada pemberian kinetin yang relatif tinggi, diferensiasi kalus cenderung ke arah pembentukan primordia batang atau tunas.
1. Efek Fisiologis dari Sitokinin
Sitokinin memepengaruhi berbagai proses fisiologis di dalam tanaman. Aktivitas yang terutama ialah mendorong pembelahan sel dan aktivitas ini yang menjadi kriteria utama untuk menggolongkan suatu zat ke dalam sitokinin.
Baik efek yang menghambat maupun efek yang mendorong proses pembelahan sel oleh sitokinin tergantung oleh adanya fitohormon lainnya terutama auksin.
Sitokinin memperlambat proses penghancuran butir-butir klorofil pada daun-ddaun yang terlepas dari tanaman dan memperlambat proses senence pada daun, buah dan organ-organ lainnya.
2. Sitokinin Sintetik
Didapat sejumlah senyawa-senyawa substansi adenin yang mempunyai aktivitas seperti sitokinin didalam peertumbuhan kalus tembakau. 6-Benzile adenin (BA) mempunyai struktur yang serupa dengan kinetin. BA ini sangat aktif dalam mendorong pertumbuhan kalus tembakau. Bentuk isomernya 1-benzil adenin harus diubah menjadi 6-benzil adenin.
D. Etilen
Etilen adalah suatu gas dari pembakaran gas yang tidak sempurna dari senyawa-senyawa yang kaya akan ikatan karbon seperti batu bara, minyak bumi dan gas alam. Merupakan komponen dari asap-asap yang dikeluarkan oleh kendaraan-kendaraan bermotor dan industri-industri yang mempergunakan bahan bakar gas.
Efek Fisiologi dari Etilen
Telah diketahui bahwa etilen menjadi penyebab beberapa respon tanaman seperti pengguran daun, pembengkakan batang , pemasakan bauah dan hilangnya warna buah. Etilen mengahambat pertumbuhan kearah memanjang (longitudinal) dan mendorong pertumbuhan ke arah melintang (transversal) sehingga batang kecambah terlihat membengkak. Etilen juga merubah respon geotropisma, mendorong pengguran daun, bunga dan buah. Respon geotropisma bukan saja dipengaruhi oleh etilen tetapi juga oleh auksin, demikian juga dengan proses penuaan. Etilen sangat berperan dalam aspek-aspejk praktis penyimpanan buah.
E. Asam Absisat
Asam absisat adalah molekul seskuiterpenoid (memiliki 15 atom karbon) yang merupakan salah satu hormon tumbuhan. Selain dihasilkan secara alami oleh oleh tumbuhan, hormon ini juga dihasilkan oleh alga hijau dan cendawan. Hormon ini ditemukan pada tahun 1963 oleh Frederick Addicott. Addicott berhasil mengisolasi senyawa abscisin I dan II dari tumbuhan kapas. Senyawa abscisin II kelak disebut dengan asam absisat, disingkat ABA. Pada saat yang bersamaan, dua kelompok peneliti lain yang masing-masing dipimpin oleh Philip Wareing dan Van Steveninck juga melakukan penelitian terhadap hormon tersebut.
Hormon asam absisat merupakan senyawa yang bersifat inhibitor (penghambat) yang cara kerjanya berlawanan dengan hormon auksin dan giberelin. Salah satu fungsi auksin adalah untuk memacu proses pemanjangan sel dan pembentukan buah tanpa biji. Sedangkan salah satu fungsi dari giberelin adalah untuk mengakhiri proses dormansi pada biji yang terpengaruhi oleh asam absisat.
Tahapan lain dalam kehidupan suatu tumbuhan yang menguntungkan apabila pertumbuhan dihentikan adalah pada saat permulaan dormansi biji, dan kemungkinan asam abisatlah yang bertindak sebagai penghambat pertumbuhan. Biji akan berkecambah ketika ABA dihambat dengan cara membuatnya tidak aktif, atau dengan membuangnya atau melalui peningkatan aktivitas giberelin. Biji beberapa tumbuhan gurun mengakhiri dormansinya ketika hujan lebat melunturkan ABA dari biji. Biji tumbuhan lain memerlukan cahaya atau stimulus lain untuk memicu perombakan asam abisat. Pada sebagian besar kasus, rasio ABA terhadap giberelin akan menentukan apakah biji itu akan tetap dorman atau berkecambah.
Hormon tanaman yang dianggap sebagai hormon stress diproduksi dalam jumlah besar ketika tanaman mengalami berbagai keadaan rawan diantaranya yaitu ABA.  Keadaan rawan tersebut antara lain kurang air,  tanah bergaram, dan suhu dingin atau panas.  ABA membantu tanaman mengatasi dari keadaan rawan tersebut.
Tempat produksi atau lokasi hormon asam absisat pada tumbuhan yaitu di daun, batang, akar dan buah hijau. Fungsi utama asam absisat yaitu menghambat pertumbuhan, menutup stomata selama kekurangan air, menghambat pemutusan dormansi.


Pada daun, ABA berada pada 3 bagian sel yang berbeda, yakni : (1) pada sitosol, dimana  disintesis, (2) pada kloroplas dimana ABA diakumulasikan, dan (3) pada dinding sel. Para ahli fisiologi berpendapat bahwa ABA dapat merangsang penutupan stomata adalah ABA yang berada pada dinding sel. ABA pada dinding sel ini berasal dari  sel-sel mesofil daun tempat di mana ABA ini disintesis.
Asam Absisat diangkut oleh tumbuhan secara alami melalui xilem floem dan parenkim baik itu naik atau turun, proses pengangkutan menuju daun dalam penutupan stomata dari akar menuju floem yang dekonsentrasi pada daun yang dapat dipengaruhi oleh tingkat kegaraman yang tinggi. Begitupun dari daun menuju akar dan menuju batang dalam penghambatan penambahan panjang dan lebar batang pada tanaman.
Pembentukan Asam Absisat pada Tumbuhan dan Cara Kerjanya
Hormon Asam Absisat pada tumbuhan dapat diperoleh dengan cara alami melaui proses di dalam tumbuhan itu sendiri (endogen) dan melalui pemberian dari luar oleh campur tangan manusia (eksogen). Namun secara alami tumbuhan dapat menghasilkan hormon Asam Absisat di dalam tubuhnya walaupun tidak dalam jumlah yang besar dengan beberapa proses yaitu :
·         Biosintesis/pembentukan ABA pada sebagian besar tumbuhan terjadi secara  tak langsung melalui peruraian karotenoid (zat warna merah, kuning dan Orange) tertentu (40 karbon) yang ada di plastid.  ABA pergerakannya dalam tumbuhan sama dengan pergerakan giberelin yaitu dapat diangkut secara mudah melalui xilem floem dan juga sel-sel parenkim di luar berkas pembuluh. 
·         Rangkaian pose secara kimia, yaitu
a.       Jalur Asam mevalonat : Asam mevalonat → farnesylpyrofosfat → ABA
b.      Jalur Violaxanthin : Violaxanthin → Xanthoxin → ABA  -  Cahaya
Secara non-alami, Asam Absisat diperoleh melalui pemberian dari luar tubuh baik itu Asam Absisat Sintetik maupun yang diekstrak dari tumbuhan lain, misalnya Alga.
Cara kerja dari asam absisat ini seperti merangsang penutupan stomata pada waktu kekurangan air, mempertahankan dormansi dan biasanya terdapat di daun, batang, akar, buah berwarna hijau. Pengangkutan hormon ABA dapat terjadi baik di xilem maupun floem dan arah pergerakannya bisa naik atau turun. Transportasi ABA dari floem menuju ke daun dapat dirangsang oleh salinitas (kegaraman tinggi).
Pada tumbuhan tertentu, terdapat perbedaan transportasi ABA dalam siklus hidupnya. Daun muda memerlukan ABA dari xilem dan floem, sedangkan daun dewasa merupakan sumber dari ABA dan dapat ditranspor ke luar daun.
http://2.bp.blogspot.com/-Ok-XtO7RMJE/UN05o0vcd7I/AAAAAAAAAQg/rsvB0B9oOtA/s400/tdghjvfgxsnbhuedghv.jpg

Daun dan buah pada tumbuhan dapat menjadi rontok karena adanya pengaruh kerja hormon Asam Absisat (ABA). hormon ini menghambat pertumbuhan dan pembelahan sel. karena itu, jika hormon ini bekerja, proses yag terjadi di dalam sel akan berkurang dan kelamaan akan berhenti. berhentinya aktivitas sel, berarti juga berhentinya asupan nutrisi ke dalam sel tumbuhan tersebut, sehingga, bagian tumbuhan seperti daun akan kekurangan nutrisi, dan kering karena penguapan terus terjadi, namun tidak ada asupan air, dan kelamaan daun akan rontok.

Gambar : Tumbuhan kekeringan tanpa asam absisat (atas) dan cambah (A) yang tumbuh cepat dengan ditiadakannya asam absisat (bawah)

Hormon ini dapat menutup stomata pada daun dengan menurunkan tekanan osmotik dalam sel dan menyebabkan sel turgor. Akibatnya, cairan tanaman hilang yang disebabkan oleh transpirasi melalui stomata dapat dicegah. ABA juga mencegah kehilangan air dari tanaman dengan membentuk lapisan epikutikula atau lapisan lilin. Selain itu, ABA juga dapat menstimulasi pengambilan air melalui akar. Selain untuk menghadapi kekeringan, ABA juga berfungsi dalam menghadapi lingkungan dengan suhu rendah dan kadar garam atau salinitas yang tinggi. Peningkatan konsentrasi ABA pada daun dapat diinduksi oleh konsentrasi garam yang tinggi pada akar.. Dalam menghadapi musim dingin, ABA akan menghentikan pertumbuhan primer dan sekunder. Hormon yang dihasilkan pada tunas terminal ini akan memperlambat pertumbuhan dan memicu perkembangan primordia daun menjadi sisik yang berfungsi melindungi tunas dorman selama musim dingin. ABA juga akan menghambat pembelahan sel kambium pembuluh.
Terdapat beberapa kondisi Dimana hormon Asm Absisat terbentuk pada bagian tumbuhan, diantaranya pada daun, tumbuhan yang mengalami cekaman air : (kekeringan); konsentrasi ABA naik sampai lebih  dari 50 kalinya hanya dalam waktu 4-8 jam (400 ng per g berat basah); sebagai respon dari  meningkatkan laju biosintesisnya. Namun jika tumbuhan diberi air kembali; konsentrasi ABA turun sampai  ke konsentrasi sebelum cekaman dalam waktu 4-8 jam; sebagai respon menurunnya laju biosintesis.
Biji yang sedang berkembang  konsentrasi ABA sangat tinggi (100 x) ; lalu semakin menurun  seiring dengan semakin dewasanya biji karena tumbuhan sudah semakin kuat dan dapat menghasilkan makanan dalam jumlah besar serta penyerapan air yang lebih optimal melalui akar.
Kegunaan Asam Absisat bagi Tumbuhan
            Seperti yang telah dijelaskan diatas, hormon Asam Absisat berfungsi dalam menghambat pertumbuhan, hal ini dilakukan untuk membantu tumbuhan untuk bertahan dalam kondisi yang sulit, sehingga hormon absisat hanya diproduksi jika tumbuhan mengalamai kondisi seperti kekurangan air, pada musim dingin, musim kering, dan musim gugur sehingga terjadi proses-proses untuk menghambat pertumbuhan. Secara Keseluruhan, Asam Absisat berfungsi dalam :
1.      Secara fisiologis berfungsi dalam Pengaturan perkecambahan biji, Mendorong sintesis protein simpanan, Mengurangi efek kekurangan air, Peristiwa absisi, Dormansi tunas, Memacu transpor fotosintat yang sedang berkembang
     2.      Dormansi tunas
     3.      Menghambat perkecambahan biji
     4.      Mempengaruhi pembungaan tanaman
     5.      Memperpanjang masa dormansi umbi-umbian
     6.      Mempengaruhi pucuk tumbuhan untuk melakukan dormansi
   7.      Untuk maturasi biji dan menjaga biji agar berkecambah di musim yang diinginkan
    8.      Untuk menghadapi lingkungan dengan suhu rendah dan kadar garam atau salinitas yang tinggi  
     9.      Menghambat pembelahan sel kambium pembuluh.

2.9 Kelebihan dan Kekurangan Kultur Jaringan Tumbuhan
Kelebihan
1.Bibit (hasil) yang didapat berjumlah banyak dan dalam waktu yang singkat
2.Sifat identik dengan induk
3.Dapat diperoleh sifat-sifat yang dikehendaki
4.Metabolit sekunder tanaman segera didapat tanpa perlu menunggu tanaman dewasa
Kerugian
  1. Bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap hama penyakit dan udara luar
  2. Bagi orang tertentu, cara kultur jaringan dinilai mahal dan sulit.
  3. Membutuhkan modal ivestasi awal yang tinggi untuk bangunan (laboratorium khusus), peralatan dan perlengkapan.
  4. Diperlukan persiapan SDM yang handal untuk mengerjakan perbanyakan kultur jaringan agar dapat memperoleh hasil yg memuaskan
  5. Produk kultur jaringan pd akarnya kurang kokoh
  6. Mahal

2.10 Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan
Laboratorium kultur jaringan menuntut aseptisasi yang sangat tinggi. Seluruh tahapan atau prosedur teknik kultur jaringan juga harus dalam kondisi aseptic. Oleh karena itu seluruh ruangan didalam laboratorium hendaknya dalam keadaan aseptik, terutama ruangan kultur atau inkubasi harus dalam kondidi benar-benar aseptic. Pada ruangan kultur seluruh tanaman hasil perbanyakan atau hasil perlakuan ditumbuhkan.
            Laboratorium kultur jaringan sebaiknya dibangun pada daerah yang memiliki udara bersih, jauh dari debu dan polutan lainnya, hal ini untuk mengeliminir terjadinya kontaminasi. Oleh karena itu biasanya bangunan ini dibuat ditempat jauh dari keramaian. Bangunan laboratorium sebaiknya memiliki pembagian ruangan yang teratur sehingga setiap aktivitas yang berbeda dilakukan pada ruangan yang berbeda, tetapi seluruh ruangan harus saling berhubungan.
            Ruangan-ruangan pada laboratorium kultur jaringan menghendaki beberapa ruangan standart, namun dalam kenyataannya selalu dilakukan modifikasi dan hal ini sudah dilakukan oleh penulis dalam mendesain beberapa laboratorium kultur jaringan. Di bawah ini adalah beberapa ruangan yang harus ada dalam sebuah laboratorium kultur jaringan :
1.      Ruangan Analisa/Serbaguna
Ruangan ini biasanya digunakan untuk tempat menganalisis, mengamati, mendiskusikan hasil perlakuan terhadap eksplan yang telah ditanam terlebih dahulu. Hasil perlakuan yang telah dilakukan terhadap eksplan tertentu perlu diamati untuk melihat perbedaannya dan untuk membandingkannya dengan keadaan awal eksplan sewaktu ditanam. Oleh sebab itu dibutuhkan alat-alat dan ruangan untuk analisa lebih lanjut.
Alat-alat dan bahan yang ada di ruangan analisa, antara lain adalah
·         Gambar-gambar informasi tentang kultur jaringan
·         Bahan-bahan media(di dalam lemari)
·         Alat-alat yang dibutuhkan untuk pengamatan hasil kultur jaringan(milimeter blok, jangka sorong, mistar) biasanya disimpan di lemari
Di dalam ruangan ini umumnya terdapat mikroskop, objek glass dan cover glass, mikrotome dan perlengkapannya dan lup
Untuk kebutuhan yang lebih tinggi/canggih, alat-alat yang berhubungan dengan pengamatan DNA juga diperlukan seperti: inkubator atau water bath, lemari es, sentrifuge, elektroforesis, pipet mikro dengan berbagai ukuran, eppendorf 1,5 ml dan 25µl, ujung tip dengan berbagai ukuran dan perlengkapan pengamatan(larutan atidium bromide), kamera foto folaroid tipe tertentu atau komputer yang dilengkapi dengan kamera khusus untuk pengamatan DNA.
2.      Ruangan Sterilisasi
Ruangan sterilisasi adalah ruangan tempat dimana seluruh alat kultur jaringan dibersihkan. Sebaiknya ruangan sterilisasi dibagi dua bagian, yaitu ruangan pertama digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang terkontaminasi, ruangan kedua digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang terkontaminasi. Untuk mensterilkan alat yang tidak terkontaminasi alat yang dibutuhkan di dalam ruangan ini adalah wastafel dan autoklaf.
            Untuk mensterilakan alat-alat atau botol yang terkontaminasi haruslah dipisahkan ruangan dan peralatan yang digunakan. Pada laboratorium berskala besar, ruangan ini dilengkapi dengan autoklaf yang khusus digunakan untuk mensterilkan botol yang terkontaminasi, jadi botol-botol yang berisi tanaman yang terkontaminasi terlebih dahulu di autoklaf sebelum dicuci secara bersih di wastafel.
            Pengalaman penulis selama melakukan penelitian, alat-alat yang digunakan untuk mencuci botol yang terkontaminasi haruslah dibedakan atau dipisah deangan alat untuk mencuci botol yang tidak terkontaminasi, baik kain pencuci, batang kayu dan wadahnya.
            Jika kita tidak memiliki autoklaf dalam jumlah banyak, kondisi ini dapat diatasi dengan cara memisahkan tempat dan alat pencuci botol terkontaminasi dengan botol yang tidak terkontamiasi. Pengalaman memnunjukkan botol terkontaminasi harus dicuci dua kali untuk memastikan botol benar-benar bersih sebelum dilanjutkan dengan mengautoklafnya.
           Pembagian ruangan sterilisasi dpat juga dengan cara sebagai berikut :
·         Kamar mandi, digunakan untuk tempat pencuci botol yang terkontaminasi.
·         Ruangan yang memiliki wastafel, untuk tempat pencucian alat-alat yang bersih
Alat dan bahan yang harus ada pada ruangan ini antara lain: alat pencuci botol seperti kain atau sabut pencuci, sikat gigi, sikat panjang, batang kayu (untuk mencuci botol besar), autoklaf.
Autoklaf ada beberapa jenis, autoklaf sederhana dengan sumber listrik dan dengan kompor gas dan autoklaf programmable. Autoklaf jenis ini memiliki perangkat pengukur tekanan dan timer untuk mengukur waktu.
3.      Ruangan Preparasi
Ruangan preparasi adalah ruangan yang digunakan untuk mempersiapkan eksplan, membuat media dan hal lainnya. Pada ruangan ini dibutuhkan fasilitas, seperti meja untuk mempersiapkan bahan tanaman, untuk meletakkan alat-alat. Ruanagan persiapan dibutuhkan untuk :
·      Mempersiapkan atau membuat media kultur jaringan, mempersiapkan dan mensterilisasi eksplan dari lapang yang akan digunakan
·      Tempat mencuci alat membuat media
·      Tempat penyimpanan alat-alat gelas
·      Tempat penyimpanan zat kimia, media kultur jaringan
Alat-alat kultur jaringan yang umumnya terdapat dalam ruangan preparasi ini adalah :
1.   Alat gelas standard
ü  Beaker glass dengan berbagai ukuran, misalnya : 100 ml, 500 ml
ü  Gelas ukur : 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml, 500 ml, 1000 ml
ü  Pipet tetes
ü  Pipet dengan berbagai ukuran
ü  Erlenmeyer : 100 ml, 500 ml, 1000 ml
ü  Petridish
ü  Pipet mikro
ü  Botol kultur kecil : tempat alat tanam pada saat penanaman
ü  Botol kultur besar : tempat media dan plan ditumbuhkan batang pengaduk
  2. Alat-alat tanam yang telah bersih : gunting, pinset, pisau, spatula, petridish, scalpel dan lain-lain.
  3. Spatula
  4. Timbangan analitik
  5. Lemari es : untuk menyimpan larutan stok, vitamin dan zat pengatur tumbuh.
  6. Hot plate dengan magnetik stirer
  7. Lampu bunsen
  8. Open atau inkubator
  9.  PH meter (pH meter manual atau digital) atau kertas indikator.
  10. Autoklaf
  11. Panci
`     12. Alat pencuci
  13. Rak piring kecil untuk pengeringan alat
  14. Lemari, tempat alat-alat, bahan kimia dan alat lain seperti aluminium foil, karet, plastik.
  15. Sentrifuse (untuk pengembangan laboratorium)
  16. Shaker (untuk pengembangan laboratorium)
  17. Lemari asam (jika diperlukan)
18. Kereta dorong atau troli, untuk mengangkat media dan alat setelah di autoklaf ke   ruangan isolasi atau transfer                    
4.      Ruangan Transfer
Pada ruangan transfer ini, kondisi harus benar-benar aseptik. Di dalam ruangan inilah dilakukan isolasi bagian tanaman yang hendak ditanam, sterilisasi eksplan tahap kedua, dan penananman ke media tanam. Pintu-pintu penghubung harus senantiasa tertutup rapat sehingga kemungkinan debu yang akan masuk sangat kecil.
      Ruangan ini harus berhubungan dengan ruangan kultur, karena setelah penanaman, maka botol berisi tanaman dibawa ke ruang kultur. Juga harus berhubungan dengan ruang preparasi, untuk kemudahan pengangkatan botol berisi media, alat tanam dan yang lainnya. Ruangan ini juga harus berhubungan dengan ruang analisa, untuk  keperluan pengamatan mikroskopis. Ruangan senantiasa dibersihkan dengan desinfektan seperti karbol. Idealnya ruanagn-ruangan di dalam laboratorium hendaknya saling berhubungan.
      Didalam ruangan ini terdapat alat-alat antara lain :
-          Laminar Air Flow Cabinet
-          Mikroskop
-          Meja dorong (di dalam skala besar digunakan troli) untuk mengangkat media yang akan digunakan
-          Alat-alat tanam seperti: pisau, gunting, pinset, petridish, botol mini tempat alkohol, disposible filter atau milipore, yang berguna untuk sterilisasi bahan-bahan yang tidak tahan terhadap suhu tinggi
-          Hand prayer yang diisi alkohol 70 %
-          Lampu bunsen beserta isinya yaitu spirtus
-          Lemari: tempat alat-alat dan alkohol
-          Timbangan digital
5.      Ruangan Kultur
Ruangan ini merupakan ruangan terbesar dari seluruh ruangan yang diperlukan dan harus dimungkinkan untuk melakukan perluasan, karena kemungkinan senantiasa terjadi pertambahan kultur setiap periode tertentu. Kultur yang tumbuh dan mampu memperbanyak diri, maka harus senantiasa disubkultur setelah 2-3 bulan tergantung jenis tanamannya.
Tingkat aseptisitas ruangan ini harus lebih baik dari seluruh ruangan yang ada, hal ini dikarenakan di ruangan inilah tanaman botol diletakkan. Botol kultur berisi tanaman disususn pada rak-rak. Jarak antar rak harus diatur sedemikian rupa, sehingga memudahkan kita memeriksa tanaman di rak kultur.
Pada ruangan ini senantiasa AC hidup, yang berguan untuk penyaringan udara yang masuk dan juga untuk mempertahankan tanaman supaya tetap hidup dengan mempertahankan pada kondisi suhu tertentu.
Ruangan kultur harus memiliki pengaturan terhadap suhu (dengan menggunakan AC) dan cahaya (dengan pemberian lampu). Walaupun diketahiu bahwa proses pada tanaman yang ditanam pada kultur jaringan bukanlah fotosintesis murni, melainkan foto organogenesis melalui pemenuhan kebutuhan karbohidrat dari gula dan juga bahan hara lainnya di dalam media, namun cahaya sangat diperlukan untuk mengendalikan perkembangan eksplan.
            Kualitas cahaya yang baik untuk perkembangan tanaman harus diperhatikan. Lampu flourescens jauh lebih baik dibandingkan lampu pijar, karena panasnya relatif rendah. Intensitas cahaya yang dibutuhkan berkisar: 1000 – 4000 lux. Intensitas cahaya diatur dengan  menempatkan lampu dengan kekuatan tertentu, dengan jarak 40-50 cm dari tabung kultur dan untuk luas tertentu. Umumnya tanaman kultur jaringan membutuhkan sekitar 14-16 jam untuk panjanng penyinaran yang dibutuhkan. Untuk laboratorium berskala besar dan untuk akurasi penyinaran, timer otomatis digunakan untuk mengukur lamanya penyinaran.
           Suhu di dalam ruangan kultur juga merupakan aspek penting yang harus diperhatikan, umumnya suhu 18-25°C selalu diterapkan, namun beberapa tanaman membutuhkan temperatur yang lebih rendah. Untuk penelitian dan perlakuan tertentu, misalnya pengumbian kentang yang dilakukan di PPSHB Bioteknologi IPB, suhu 20°C dan penggunaan ruang gelap mutlak diperlukan untuk proses mendapatkan umbi mikro kentang.
      Alat yang harus tersedia di ruang kultur adalah :
-          Rak kultur yang dilengkapi dengan lampu florescens
-          Timer, untuk pengukuran waktu
-          AC, untuk pengaturan suhu dan penyaringan udara
-          Mikroskop, loupe, penggaris, milimeter blok
-          Shaker
6.      Ruangan Stok
Untuk pembuatan media kultur jaringan, dibutuhkan zat hara makro, mikro dan trace element lainnya. Untuk kemudahan pembuatan media dan mengeliminir kesalahan, maka zat-zat hara yang hanya dibutuhkan dalam jumlah sangat sedikit tersebut, dibuat dalam bentuk stok larutan, artinya dilakukan pemekatan larutan, sehingga dalam pembuatan media, kita hanya melakukan pemipetan dalam jumlah kecil sesuai dosis yang dibutuhkan. Oleh karena itu dibutuhkan ruangan yang berfungsi untuk menyimpan stok yang telah dibuat tersebut. Ruangan ini berhubungan dengan ruang preparasi dan ruang kultur. Umumnya alat yang ada di ruangan ini adalah lemari es, untuk menyimpan stok dalam bentuk larutan dan beberapa zat kimia lainnya.

2.11 Aklimatisasi Tanaman Hasil Kultur In Vitro
Aklimatisasi adalah suatu tahapan penyesuain diri tanaman hasil kultur jaringan terhadap lingkungan sekitar. Aklimatisasi dapat disebut juga sebagai tahapan penyesuaian diri, sebelum pada akhirnya tanaman mampu hidup di lapangan. Tahapan ini sering diabaikan oleh banyak orang, mereka senantiasa lebih terfokus pada perawatan tanaman in vitronya. Padahal, seunggul apapun tanaman yang dihasilkan dari teknik kultur jaringan tersebut, jika tidak dilakukan proses aklimatisasi dengan benar maka tanaman yang dihasilkan dari teknik kultur jaringan tersebut akan mati.
Dibawah ini dituliskan beberapa saran dan petunjuk untuk melakukan aklimatisasi pada berbagai jenis tanaman, untuk lebih lengkapnya tentang aklimatisasi yaitu:
1.      Proses aklimatisasi adalah proses penyesuaian diri, disarankan jika tanaman kultur hendak dipindah, maka harus diperhatikan media tumbuh yang tepat untuk tanaman tersebut.
2.      Sebelum digunakan, media tumbuh harus “dijenuhi dengan air”. Hal ini dilakukan karena tanaman berikut media tumbuh (biasanya ditanam dengan pot gelas aqua), harus disungkup selama 1-2 hari, sehingga diperlukan sedikit kelembaban.
3.      Pemakaian tray untuk tempat aklimatisaasi juga dapat digunakan, tetapi harus menggunakan sungkup plastik selama beberapa hari sebelum sungkup dibuka.
4.      Tanaman diletakkan pada ruang kultur selama 1-2 hari, setelah itu baru dipindah ke luar ruangan. Penutup/sungkup dibuka sedikit demi sedikit agar tanaman secara perlahan-lahan mampu menerima kondisi alam luar.
5.      Tanaman tidak langsung ditanam dilapangan, tetapi masih memerlukan naungan untuk beberapa hari sampai tanaman tersebut benar-benar kuat untuk ditanam dilapang.
6.      Berdasarkan pengalaman penulis, untuk tanaman nenas, daun dewa, krisan, pertumbuhan anakan lanjutan dapat dilakukan langsung dibawah terik matahari. Untuk tanaman anggrek memerlukan naungan 30-50% sesuai habitat aslinya. Khusus untuk tanaman manggis, mulai saat dikeluarkan dari botol kultur, masa anakan sampai umur 3 tahun, manggis memerlukan naungan sekitar 50%, biasanya digunakan paranet ataupun nipah yang berlubang.

2.12 Kultur Jaringan Tanaman Manggis
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
            Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pusat Kajian Buah-buahan Tropika, Laboratorium Molekuler dan Selluler Tanaman Pusat Penelitian Bioteknologi IPB dari bulan September 2001 sampai Mei 2002

Bahan dan Alat
            Bahan yang digunakan adalah biji manggis dengan berat 1 gram, dan media tumbuh yang digunakan adalah media Murashige dan Skoog (MS) dengan kandungan Nitrogen ½ N, MS, Woody Plant Medium (WPM).
            Alat yang digunakan adalah botol, gelas ukur, gelas piala, cawan petri, timbangan analitik, kertas lakmus, autoclave, laminar air flow cabinet, pinset, pisau, scalpel, lampu spirtus, sprayer, dan rak kultur.

RANCANGAN PERCOBAAN
            Rancangan percobaan untuk media pertumbuhan adalah rancangan acak lengkap (RAL) factorial yang terdiri dari dua faktor yaitu :
1.      Konsentrasi BAP yang digunakan sebanyak 5 taraf yaitu :
a.       0 ppm
b.      2,5 ppm
c.       5 ppm
d.      7,5 ppm
e.       10 ppm
2.      Pola Pemotongan eksplan sebanyak 7 taraf yaitu :
a.       Biji utuh
b.      Biji dipotong dua
c.       Biji dibelah dua
d.      Biji dipotong tiga
e.       Biji dibelah tiga
f.       Biji dibelah potong empat
g.      Biji dibelah empat

Rancangan percobaaan untuk optimasi media perakaran adalah rancangan acak lengkap satu faktor. Beberapa diantara media yang digunakan adalah hasil penelitian oleh peneliti dahulu : media 2, media 4, media 8, media 9, media 10, dan media 11.
Komposisi media pengakaran tersebut adalah :
o   MS + IBA 4 mg + NAA mg/l
o   MS ½ N + IBA 4 mg + NAA 3 mg/l
o   WPM + IBA 4 mg + NAA 3 mg/l
o   MS ½ N + IBA 3 mg + NAA 4 mg/l
o   WPM + IBA 3 mg + NAA 4 mg/l
o   Eksplan direndam selama 5 hari dalam media MS ½ N + IAA 500 mg/l, kemudian dipindah ke media MS ½ N + BAP 1 mg/l + NAA 1 mg/l
o   Eksplan direndam selama 5 hari dalam media MS ½ N + IAA 1000 mg/l, kemudian dipindah ke media MS ½ N + BAP 1 mg/l + NAA 1 mg/l
o   Eksplan direndam selama 5 hari dalam media MS ½ N + IBA 500 mg/l, kemudian dipindah ke media MS ½ N + BAP 1 mg/l + NAA 1 mg/l
o   Eksplan direndam selama 5 hari dalam media MS ½ N + IBA 1000 mg/l, kemudian dipindah ke media MS ½ N + BAP 1 mg/l + NAA 1 mg/l
o   Eksplan direndam selama 5 hari dalam media WPM  +  NAA 500 mg/l, kemudian dipindah ke media MS ½ N + BAP 1 mg/l + NAA 1 mg/l
o   Eksplan direndam selama 5 hari dalam media WPM  +  NAA 1000  mg/l, kemudian dipindah ke media MS ½ N + BAP 1 mg/l + NAA 1 mg/l
Masing-masing perlakuan yaitu media pertumbuhan dan pengakaran terdiri dari 10 ulangan, tiap ulangan terdiri dari 5 botol dengan 1 ekplan/botol.

Pelaksanaan Penelitian
a.       Sterilisasi Biji
Biji disterilisasi dengan cara disikat, sambil direndam detergen kemudian dicuci, seterusnya direndam benlate dan agromycin masing-masing dengan konsentrasi 2 gr/250 ml selama 12 jam. Biji dicuci degan air steril 3x, kemudian direndam klorox 20% selama 15 menit, dicuci dengan air steril 3x, direndam kembali dengan klorox 10% selama 20 menit, dicuci dengan air steril 3x, terakhir direndam dengan amoxilin 500 mg/l sampai penanaman dilakukan.
b.      Penanaman Eksplan
Biji-biji terpilih dipotong sesuai perlakuan, kemudian eksplan ditanam dalam media MS ½ N yang dimodifikasi dengan BAP 0 ppm, 2,5 ppm, 5 ppm, 7,5 ppm, 10 ppm. Biji diletakkan dengan bagian luka menempel pada media, kemudian diletakkan di rak kultur. Tunas berukuran tinggi 3 cm, dipotong kemudian ditanam pada berbagai media pengakaran.
c.       Pengamatan dilakukan terhadap beberapa peubah
o   Waktu munculnya tunas dan daun
o   Pengamatan visual berupa penampilan tunas yang muncul
o   Jumlah dan persentase eksplan bertunas
o   Jumlah tunas setiap eksplan yang diamati setiap minggu. Tunas yang dihitung adalag tunas yang sudah membentuk primordial daun.
o   Jumlah daun setiap tunas yang diamati setiap minggu. Dihitung mulai dari daun yang paling bawah sampai daun yang masih agak kuncup.
o   Jumlah ruas, diamati setiap minggu yang dihtung mulai dari pangkal ruas paling bawah hingga ruas dibawah daun paling atas.
o   Jumlah dan persentase tunas yang berakar
o   Jumlah akar
o   Panjang akar




HASIL DAN PEMBAHASAN
Optimasi Media Pertumbuhan
Tabel 1. Pengaruh ZPT BAP dan pola pemotongan eksplan terhadap waktu munculnya tunas, daun dan persentase eksplan bertunas.
BAP
Pola Pemotongan Eksplan

1
2
3
4
5
6
7
Rataan (MST)
Muncul Tunas (MST)

0
3
3
3
3
5
6
6
4,14
2,5
2
2
2
2*
2
3
3
2,29
5
2
2*
2*
2
2*
2*
2
2,00
7,5
2
2
2
2
2
3*
3
2,29
10
4
3
3
3
3
4
4
3,43

Muncul Daun (MST)

0
5
5
5
5
5
5
5
5,00
2,5
4
4
4
4
3
3
3
3,57
5
4
3
3
4
3
2
4
3,29
7,5
4
3
4
4
4
4
3
3,71
10
4
5
5
5
5
5
3
4,86

Persentase Eksplan Bertunas

0
50(5/10)
50(5/10)
50(5/10)
40(4/10)
30(3/10)
40(4/10)
30(3/10)
41,43
2,5
80(8/10)
80(8/10)
90(9/10)
80(8/10)
80(8/10)
90(9/10)
80(8/10)
82,86
5
90(9/10)
90(9/10)
90(9/10)
90(9/10)
90(9/10)
100(10/10)
90(9/10)
91,43
7,5
80(8/10)
80(8/10)
80(8/10)
80(8/10)
70(7/10)
80(8/10)
70(7/10)
77,14
10
70(7/10)
50(5/10)
50(5/10)
80(8/10)
60(6/10)
70(7/10)
60(6/10)
62,86


*2 tunas berakar
*3 tunas berakar
*2 tunas berakar
*1 tunas berakar
*1 tunas berakar



Keterangan : Pola Pemotongan Eksplan
1 = Biji utuh
2 = Biji dipotong dua
3 = Biji dibelah dua
4 = Biji dipotong tiga
5 = Biji dibelah tiga
6 = Biji dipotong belah empat
7 = Biji dibelah empat
Dari penelitian ini didapat bahwa BAP sangat berperan untuk menginduksi munculnya tunas, namun ada batasan konsentrasi optimum, konsentrasi yang sangat tinggi memperlambat keluarnya tunas.  Pengamatan secara visual pada perlakuan dengan konsentrasi tinggi menunjukkan bahwa eksplan mengalami pembengkakakn dan memiliki banyak bakal tunas, namun bakal tunas ini tidak pecah menjadi tunas.

Jumlah Eksplan yan Membentuk Tunas
            Eksplan yang ditanam di media tidak semuanya dapat membentuk tunas. Tanpa perlakuan BAP dengan semua tipe pemotongan, hanya 41,43% eksplan membentuk tunas. Dengan perlakuan BAP sebesar 2,5 ; 5 ; 7,5 dan 10 ppm dengan semua pemotongan secara berturut-turut membentuk tunas 82,86% ; 91,43% ; 77,14% ; 62,86%.
            Dari seluruh perlakuan, hanya eksplan dengan kombinasi perlakuan BAP dengan pola pemotongan 6 yang seluruhnya dapat membentuk tunas.  Sampai akhir pengamatan (12 MST) terlihat bahwa eksplan dengan perlakuan BAP 5 ppm dengan semua tipe pemotongan, memperlihatkan respon lebih tinggi, yakni jumlah eksplan yang membentuk tunas lebh banyak disbanding dengan perlakuan lainnya.
            Dari data diatas terlihat bahwa untuk menginduksi munculnya tunas pada eksplan manggis secara in vito, zat pengatur tumbuh BAP sangat dibutuhkan. Goh et al melaporkan bahwa penggunaan 5 ppm BAP efektif untuk menginduksi pertunasan pada eksplan daun muda manggis pada media MS, WPM dan B5.

Jumlah Tunas
            Dari pengamatan setiap minggu terlihat bahwa terjadi kenaikan rat-rata jumlah tunas setiap ekpslan karena pengaruh BAP.

Jumlah Daun
            Berdasarkan pengamatan dari awal sampai akhir pengamatan, didapatkan bahwa BAP menunjukkan pengaruh sangat nyata terhadap jumlah daun yang terbentuk. Tipe pemotongan eksplan ini tidak berpengaruh nyata, Inteaksi BAP dan tipe pemotongan eksplan berpengaruh nyata dan sangat nyata sampai pengamatan 6 MST, 7 MST sampai akhir pengamatan tidak menunjukkan pengaruh yang nyata.

Jumlah Ruas
            Berdasarkan pengamatan dari awal sampai akhir pengamatan, didapatkan bahwa BAP menunjukkan pengaruh yang nyata terhadap jumlah ruas pada taraf 0,01 dari awal (3 MST) hingga akhir pengamatan (12 MST). Pola pemotongan eksplan umumnya tidak berpengaruh nyata kecuali pengamatan minggu ke-5. Interaksi BAP dengan pola pemotongan eksplan berpengaruh nyata dan sangat nyata pada awal pengamatan, namun pada 7 MST sampai akhir pengamatan tidak berpengaruh.

Optimasi Media Pengakaran
            Berdasarkan pengamatan yang dilakukan didapat bahwa perlakuan jenis media berpengaruh sangat nyata terhadap panjang akar, dan jumlah akar yang terbentuk.
Menurut Wetherel, agar terjadi pembentukan akar maka komposisi media harus dirubah. Hormon sitokinin harus dikurangi ata dihilangkan sedangkana auksin penting sebagai inisiator pertumbuhan akar. Pembentukan akar pada tunas in vitro hanya memerlukan auksin tanpa atau hanya sedikit sitokinin. Nisbah auksin sitokinin yang tinggi akan mendorong morfogenesis akar. IBA dan NAA banyak digunakan untuk mendorong pertumbuhan akar stek tanaman berkayu dan tanaman berbatang lunak.

KESIMPULAN
            Zat pengatur tumbuh BAP mempengaruhi pertumbuhan tanaman manggis dan waktu munculnya tunas. Konsentrasi BAP 5 ppm memberikan hasil tertinggi pada kemampuan eksplan membentuk tunas, jumlah tunas, jumlah daun, jumlah ruas batang tanaman manggis.
            Pola pemotongan eksplan tidak mempengaruhi pertumbuhan tanaman manggis yang ditanam secara in vitro. Pola pemotongan eksplan dibelah potong empat dan dipotong dua memberikan hasil yang paling baik dalam menghasilkan jumlah tunas, daun, ruas tanaman manggis disbanding pola pemotongan eksplan lain.
            Media terbaik untuk menginduksi terbentuknya tunas manggis yang ditanam secara in vitro adalah MS ½ N + BAP 5 ppm dengan biji dibelah potong empat, sedangkan media pengakaran yang terbaik untuk tanaman manggis yang ditanam secara in vitro adalah MS ½ N + IBA 3 mg + NAA 4 mg/l.














BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
Kultur jaringan atau budidaya in vitro adalah suatu  metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, jaringan atau organ yang serba steril, ditumbuhkan pada media buatan yang steril, dalam botol kultur yang steril dan dalam kondisi yang aseptik, sehingga bagianbagian tersebut dapat memperbayak diri dan beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap.
Kelebihan Kultur Jaringan
1. Bibit (hasil) yang didapat berjumlah banyak dan dalam waktu yang singkat
2. Sifat identik dengan induk
3. Dapat diperoleh sifat-sifat yang dikehendaki
4. Metabolit sekunder tanaman segera didapat tanpa perlu menunggu tanaman dewasa
Kerugian Kultur Jaringan
  1. Bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap hama penyakit dan udara luar
  2. Bagi orang tertentu, cara kultur jaringan dinilai mahal dan sulit.
  3. Membutuhkan modal ivestasi awal yang tinggi untuk bangunan (laboratorium khusus), peralatan dan perlengkapan.
  4. Diperlukan persiapan SDM yang handal untuk mengerjakan perbanyakan kultur jaringan agar dapat memperoleh hasil yg memuaskan
  5. Produk kultur jaringan pd akarnya kurang kokoh
  6. Mahal
Manfaat Kultur Jaringan adalah :
v  Mendapatkan tanaman baru dalam jumlah banyak dalam waktu yang relatif singkat, yang mempunyai sifat fisiologi dan morfologi sama persis dengan induknya.
v  Dapat diperoleh sifat-sifat tanaman yang dikehendaki
v  Metabolit sekunder tanaman segera didapat tanpa perlu menunggu tanaman  dewasa
v  Produksi tanaman bebas virus dengan teknik kultur meristem.
v  Pelestarian plasma nutfah tanaman juga dapat dilakukan dengan teknik kultur jaringan dengan penyimpanan untuk jangka panjang.
v  Untuk dapat menghasilkan tanaman dengan jumlah banyak dan beragam.
v  Perbanyakan tanaman secara besar-besaran telah dibuktikan keberhasilannya pada perkebunan kelapa sawit dan tebu.
v  Usaha yang paling tepat untuk melestarikan tanaman yang terancam punah.
v  Kultur jaringan juga mempunyai manfaat yang besar dibidang farmasi, karena dari usaha ini dapat dihasilkan metabolit skunder upaya untuk pembuatan obat-obatan.
v  Melalui perbanyakan vegetatif dengan kultur jaringan ternyata juga berpengaruh terhadap devisa negara. Misalnya, dengan terlaksananya ekspor tanaman anggrek ke negara lain, maka akan menaikkan devisan negara dibidang pertanian.
v    Pelaksanaannya tidak tergantung pada musim










2 komentar: